Лигногумат калия норма расхода


свойства, инструкция по применению, эффективность

Лигногумат, безусловно, принципиально новое средство в агротехнике и один из основных факторов, обеспечивающих переход к органическому земледелию. Лигногуматы разработаны в РФ и выпускаются также в России ООО «НПО “РЭТ”» (Реализация Экологических Технологий). О качестве разработки говорит хотя бы тот факт, что у аграриев таких откровенно-антироссийски настроенных стран, как Канада и Украина, лигногуматы идут нарасхват, а о санкциях против их производителя и не заикаются самые оголтелые из тамошних радикалов. Сравнивать достоинства и недостатки лигногуматов нет нужды: первых уйма, вторых просто нет. Некоторым недостатком лигногуматов можно считать их сравнительно высокую стоимость, но прирост урожайности в 20-30% в сочетании с мизерными нормами расхода препаратов с лихвой ее компенсируют.

Видеопрезентацию лигногуматов см. в ролике:

Видео: презентация лигногумата от производителя


Что дает лигногумат?

Лигногумат не только и не столько удобрение. Применение лигногуматов дает след. положительные эффекты (в порядке убывания важности, хотя все они значительны):

  1. Практически полную безопасность применения для человека, пчел и всего живого;
  2. Гумирование грунта, т.е. обогащение гумусом имеющей в общем случайный состав и структуру «просто земли»;
  3. Структурирование почвы и привлечение в нее полезных обитателей грунта;
  4. Повышение стрессоустойчивости растений;
  5. Ускорение развития и увеличение плодоношения растений;
  6. Улучшение товарности (крупности, сочности, питательности и вкуса) плодов;
  7. Снижение доз минеральных удобрений без падения урожайности и качества сельхозпродукции;
  8. Существенное усиление действия биопрепаратов защиты растений;
  9. Уменьшение негативных эффектов от действия на растения и почву пестицидов;
  10. Полноценную подкормку растений мезо- и микроэлементами;
  11. Профилактику бактериальных и грибковых заболеваний растений, т.к. лигногуматы обладают бактерицидными и фунгицидными свойствами;
  12. Очень большую технологическую широту: норма расхода лигногумата может варьироваться в больших пределах (см. далее) как опытными аграриями по своему усмотрению, так и дилетантами случайно. На положительные эффекты препарата это практически не влияет, а отрицательных не вызывает.

Примечание: основной общий эффект от применения лигногуматов – предотвращение истощения почвы и, при регулярном длительном применении, рекультивация деградировавших почв, в т.ч. и при условии умеренного применения пестицидов. Похоже, лигногуматы способны заполнить «провал» защиты растений при переходе с ядохимии на биозащиту. О результатах применения лигногуматов на огороде см. сюжет ниже:

Видео: гумат калия — свойства и применение

Состав и действие

Основа химического состава лигногуматов – соли щелочных металлов гуминовых и фульвовых кислот. Те и другие – кислоты почвенные, но естественное почвообразование обеспечивается в основном соединениями гуминовых кислот — гуматами. Фульвовые кислоты в этом отношении много эффективнее, а их благотворное влияние на растения сильнее, но фульваты менее стойки. Применение лигногуматов дает «впрыск» фульватов в почву. Это активизирует жизнедеятельность растений и способность их усваивать питательные вещества, но в таком случае возможен дефицит микроэлементов питания, особенно на истощенных почвах. Поэтому в состав лигногуматов с обозначением М в названии вводятся микроэлементы в хелатной форме. Напомним читателям, что хелаты долго хранят активные, т.е. усваиваемые растениями, ионы и атомы элементов питания и по мере потребности отдают их растениям. Действующих веществ из не хелатированных удобрений много теряется, а микроэлементы могут вовсе пропасть зря.

Лигногуматы марок А

Лигногуматы выпускаются марок от А до Д на основе натрия и калия. Однако обозначения «лигногумат калийный» или «натриевый» не значат, что в составе препарата есть активные калий или натрий; это лишь обозначение способа получения препарата из сырья – продукта переработки древесины лигносульфоната. Эти буквы ставятся первыми в торговом обозначении препарата и указывают на его препаративную форму: марка А – водорастворимая (ВР) масса или гранулы (см. рис.) с содержанием действующих веществ не менее 90%, а марка Б – ее готовый 20% водный раствор, который по правилам агрохимической номенклатуры обозначается также ВР; потому и введена дополнительная маркировка. Лигногуматы «Б» опять-таки дороже, но:

  • Легче дозируются для применения на малых площадях.
  • Могут применяться немедленно, без отстаивания рабочего раствора.
  • Пригодны для применения в системах капельного полива, т.к. растворяются до рабочей концентрации (см. далее) совершенно без осадка.
  • Только лигногуматы марок Б пригодны как присадки-антидепрессанты к пестицидам без предварительной пробы на совместимость, см. далее.

Химический состав и свойства лигногуматов, получаемых с помощью лигносульфонатов натрия и калия, несколько отличаются: лигногумат натриевый более пригоден для тепличного хозяйства, а на открытом грунте для огурцов и тыквенных. Для ЛПХ рекомендован лигногумат калия марок А, Б, АМ и БМ как наиболее универсальный.

Химический состав лигногуматов не вполне стабилен: он несколько зависит от исходного сырья (отходов деревообработки) и способов его переработки, но на потребительские свойства и действенность препаратов качество сырья заметно не влияет; это, пожалуй, и есть главное достижение НПО РЭТ. Усредненный, так сказать, состав лигногуматов для применения в ЛПХ дан в табл. ниже. Буква «М» в обозначении указывает на наличие хелатов микроэлементов. Лигногуматы «М» дороже и пригодны во всех случаях применения (см. далее). Лигногуматы без «М» предназначены для применения по достаточно плодородным, но плохо структурированным почвам, для ускорения компостирования пищевых отходов на удобрение и как присадки к ядохимикатам. Лигногуматы «М» применяются по истощенным почвам и в тепличном хозяйстве.


Меры предосторожности

Лигногуматам назначен 4-й класс опасности (мало опасное вещество) для человека, пчел и водных организмов, но только потому, что 5-й (безопасное) агрохимии не присваивается. Препараты лигногуматов негорючи, нетоксичны и взрывобезопасны. Практически лигногуматы не опаснее огородной земли и меры предосторожности для работы с ними нужны элементарные: рабочая одежда, перчатки.

Примечание: при работе с препаратами марки Б желательно надеть защитные очки, см. ниже.

Охранные зоны для работы с лигногуматами по той же причине не устанавливаются – данные препараты пригодны для использования в комнатном растениеводстве по регламенту для цветочных культур, см. далее. Единственно что – вследствие достаточно высокой щелочности препаратов их попадание в глаза, рот и внутрь может вызвать легкий или средней тяжести химический ожог слизистых оболочек. Поэтому хранить лигногуматы нужно по общим для агрохимии правилам: в отдельном недоступном для детей и животных помещении. Желательно, чтобы на тару с препаратами не падал прямой солнечный свет, т.к. лигногуматы не сильно, но фотолитичны. Если же препарат лигногумата (особенно марки Б) пролит/просыпан либо попал на тело, внутрь или в глаза, то необходимо:

  1. Глаза и/или кожу – промыть открытыми под струей чистой воды без мыла и моющих средств. Если попал в рот, но не проглочен – несколько раз прополоскать его розовым раствором марганцовки и затем чистой водой.
  2. При попадании внутрь – выпить 2-3 стакана розового раствора марганцовки и спустя 2-3 мин вызвать рвоту. Затем принять 1-2 таблетки активированного угля и запить стаканом воды.
  3. Пролитый или просыпанный препарат нейтрализуется разведенным втрое столовым уксусом.

Совместимость и растворение

Лигногуматы совместимы в баковых смесях с большинством пестицидов и всеми биопрепаратами. Однако концентрированные растворы лигногуматов имеют pH>10, т.е. являются щелочами средней силы. Поэтому, во-первых, их нельзя совмещать с рабочими растворами, имеющими pH<5,5 – ДВ выпадут в нерастворимый осадок. Во-вторых, из препаратов лигногуматов нельзя готовить маточные растворы: концентрат марки Б вливается тонкой струей при непрерывном помешивании непосредственно в бак опрыскивателя, а массу марки А сразу разводят в рабочем объеме воды, дают осадку отстояться, а затем, если препарат используется как присадка-антидепрессант к пестицидам, производят пробу на совместимость обычным способом: сливают вместе, в чистой стеклянной посуде, по 50 мл рабочих растворов, неплотно (от пыли) накрывают и ждут не менее часа. Если никаких признаков химической реакции нет, растворы считают совместимыми, но в таком случае смесь нужно выработать не более чем за 4 часа.

Примечание: подробнее о технологии растворения лигногуматов см. видео ниже:

Видео: растворение гумата и обработка


Порядок применения

Основные общие правила использования лигногуматов в ЛПХ таковы:

  • Не применяйте лигногуматы совместно со стимуляторами роста растений. Фульвоваты стимулируют рост и развитие растений «мягким» способом: активизацией их жизнедеятельности в целом и усиленным синтезом собственных фитогормонов. «Гормональная атака» извне в таком случае может пагубно повлиять на растения.
  • В случае применения лигногуматов уменьшайте дозы минеральных удобрений и пестицидов на 20-25% против регламентных для данной культуры – эффект агрохимии не уменьшится за счет активизации жизненных процессов в растениях.
  • Если необходимо применить избирательные гербициды или пестициды «ударного действия» при массовом нашествии вредителей (напр. Конфидор, Танрек или Имидор от колорадского жука) или повальном заболевании растений, обязательно добавляйте в бак опрыскивателя лигногуматы (см. ниже).
  • В теплице и для комнатных растений старайтесь не применять регулярно лигногумат калия, обходясь натриевым: разложение фульватов калия в ограниченном объеме питания может вызвать перенасыщение почвы активным калием.
  • Если лигногумат А введен в систему капельного полива, то после выработки рабочего раствора заправьте расходный бак чистой водой и проведите полив для промывки сопел.

Инструкция по применению лигногуматов в личном подсобном хозяйстве дана в табл. ниже:

Обработка небольшого количества картофелин на посадку производится обычным способом: материал рассыпают на пленке и опрыскивают половинным расходом рабочего раствора. Затем клубни переворачивают и вырабатывают остаток раствора. Если материала много, его рассыпают нетолстым слоем и вырабатывают норму расхода в 3-4 приемов, вороша клубни после каждого опрыскивания. Альтернативный, но менее действенный способ – опрыскать все сразу, пересыпать в пластиковый мешок (мешки), закрутить его горловину и выдержать до посадки от 3 до 12 час.

Обзорные материалы:

Польза для здоровья и рекомендуемая доза

Калий - один из семи основных макроминералов. Организму человека требуется не менее 100 миллиграммов калия в день для поддержки ключевых процессов.

Высокое потребление калия снижает риск общей смертности на 20 процентов. Он также снижает риск инсульта, снижает кровяное давление, защищает от потери мышечной массы, сохраняет минеральную плотность костей и уменьшает образование камней в почках.

Основные функции калия в организме включают регулирование баланса жидкости и контроль электрической активности сердца и других мышц.

В этой статье Центра знаний MNT подробно рассказывается о рекомендуемом потреблении калия, его возможной пользе для здоровья, надежных источниках калия, последствиях слишком большого или слишком малого количества калия и любых потенциальных рисках для здоровья от потребления калия.

Краткие сведения о калии

  • Взрослые должны потреблять 4 700 миллиграммов (мг) калия в день. Однако менее двух процентов людей в США потребляют достаточно калия.
  • Калий поддерживает кровяное давление, здоровье сердечно-сосудистой системы, прочность костей и мышечную силу.
  • Свекольная зелень, белая фасоль, соевые бобы и лима - продукты с самым высоким содержанием калия.
  • Дефицит калия может привести к усталости, слабости и запорам. Это может перерасти в паралич, дыхательную недостаточность и болезненную непроходимость кишечника.
  • Гиперкалиемия означает, что в крови слишком много калия, и это также может повлиять на здоровье.
  • Калий доступен в виде добавок, но пищевые источники наиболее полезны.
Поделиться на Pinterest Калий - важнейшее питательное вещество, и очень небольшой процент людей в США.С. потребляют достаточно.

Рекомендуемое адекватное потребление калия составляет 4700 миллиграммов (мг) в день для взрослых. Большинство взрослых не соблюдают эту рекомендацию.

Национальное обследование здоровья и питания (NHANES) также показало, что менее двух процентов людей в США удовлетворяют суточную потребность в калии в 4700 мг. Женщины в среднем потребляют меньше калия, чем мужчины.

Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) рекомендует принимать 3 510 мг в день и соглашается с тем, что большая часть населения мира не выполняет эту рекомендацию.

Доступны добавки калия. Однако лучше всего получать любые витамины или минералы с пищей. Не отдельные витамины или минералы делают определенные продукты важными для здорового образа жизни, а объединенные усилия ряда питательных веществ.

Калий обладает доказанной пользой для здоровья.

Это электролит, который противодействует воздействию натрия, помогая поддерживать постоянное кровяное давление. Калий также важен для поддержания баланса кислот и оснований в организме.Основания - это щелочи, которые еще не растворились в воде.

Артериальное давление и здоровье сердечно-сосудистой системы

Низкое потребление калия неоднократно было связано с высоким кровяным давлением и сердечно-сосудистыми заболеваниями. Для снижения артериального давления необходимо поддерживать низкое потребление натрия, но не менее важно обеспечить хорошее потребление калия.

Увеличение потребления калия наряду с уменьшением натрия имеет решающее значение для снижения риска сердечно-сосудистых заболеваний.

В одном исследовании, у тех, кто потреблял 4069 мг калия в день, риск смерти от ишемической болезни сердца был на 49 процентов ниже, чем у тех, кто потреблял около 1000 мг калия в день.

Поддержание костей и мышц

Продукты, богатые калием, поддерживают щелочную среду в организме, в отличие от ацидоза. Метаболический ацидоз вызывается диетой, полной подкисляющих продуктов, таких как мясо, молочные продукты и обработанные злаки. Ацидоз - частый результат типично кислой западной диеты.

Ацидоз может вызывать выведение азота, потерю минеральной плотности костей и истощение мышц. Диета с высоким содержанием калия может помочь сохранить мышечную массу у пожилых людей, а также в условиях, которые имеют тенденцию приводить к истощению мышц, таких как диабетический кетоз. Однако достаточное потребление калия может помочь предотвратить это.

Одно исследование показало, что участники, потреблявшие 5266 миллиграммов калия в день, сохраняли в среднем на 3,6 фунта мышечной массы больше, чем участники, потреблявшие калия на 50 процентов ниже.Некоторые исследования также показывают увеличение плотности костей при высоком потреблении калия.

Продукты с высоким содержанием калия

Поделиться на PinterestБелые бобы относятся к числу продуктов, наиболее богатых калием, как и многие другие виды фасоли.

Калий содержится во многих цельных, необработанных продуктах.

Некоторые из лучших источников калия - это свежая листовая зелень, авокадо, помидоры, картофель и бобы. Обработка значительно снижает количество диетического калия. Диета с высоким содержанием обработанных пищевых продуктов, вероятно, с низким содержанием калия.

Многие обработанные пищевые продукты также богаты натрием. По мере увеличения потребления натрия необходимо повышенное содержание калия, чтобы нейтрализовать влияние натрия на кровяное давление.

Вот таблица, показывающая питательную ценность одной чашки продуктов, наиболее богатых калием.

Тип еды (1 чашка) Количество калия в миллиграммах (мг)
Вареная, вареная или дренированная свекольная зелень, без соли 1,309
Консервированная белая фасоль 1,189
Вареные, вареные или осушенные соевые бобы, без соли 970
Вареные, вареные или сушеные бобы лимские, без соли 969
Запеченный сладкий картофель 950
Ломтики авокадо 708
Вареные, вареные или сушеные грибы, без соли 555
Ломтики банана 537
Красные, спелые, сырые помидоры 427
Сырая дыня канталупа 417

Хороший способ уменьшить вредное воздействие блюд с высоким содержанием натрия - есть фрукты или овощи с высоким содержанием калия во время каждого приема пищи.

Есть еще много источников калия вне этого списка. Обязательно проверяйте содержание калия в любых предпочтительных пищевых продуктах, используя Национальную базу данных о питательных веществах Министерства сельского хозяйства США (USDA).

Дефицит калия может вызывать ряд симптомов и проблем со здоровьем. Это также известно как гипокалиемия.

Нормальный уровень калия составляет от 3,5 до 5,0 миллимолей на литр (ммоль / л).

Гипокалиемия диагностируется при падении уровня калия ниже 3.5 ммоль / л. Умеренный дефицит калия обычно протекает без симптомов. Уровень калия ниже 2,5 ммоль / л считается крайне недостаточным, и симптомы станут более серьезными по мере снижения уровня.

Симптомы низкого уровня калия включают:

  • недомогание и усталость
  • слабость и мышечные боли по всему телу
  • запор

Чрезвычайно низкий уровень калия может вызвать:

  • сильную мышечную слабость и паралич
  • дыхательная недостаточность
  • болезненные препятствия в кишечнике
  • покалывание, ползание, онемение или зуд, основные ощущения в руках, ступнях, ногах или руках
  • прерывистые мышечные спазмы

Низкий уровень калия можно диагностировать с помощью простых анализов крови и лечить с помощью изменения в диете, включая добавки.Регулярные медицинские осмотры и проверки здоровья также помогут человеку отслеживать уровень калия и избегать любых потенциальных недостатков.

Калий также может вызвать проблемы со здоровьем, когда человек потребляет больше, чем 4700 мг рекомендованного Адекватного потребления.

Люди с хорошей функцией почек могут эффективно избавлять организм от избыточного количества калия с мочой. Этот процесс обычно не имеет побочных эффектов.

Было небольшое количество сообщений о том, что токсичность калия связана с чрезвычайно высоким потреблением добавок калия.О токсичности калия, связанной с пищевыми продуктами, никогда не сообщалось.

Гиперкалиемия

Потребление слишком большого количества калия может быть вредным для людей, чьи почки не полностью функционируют. Чрезмерное потребление калия может привести к гиперкалиемии, при которой почки не могут вывести достаточное количество калия из организма. Это может быть опасно, если состояние быстро обостряется.

Уровни калия от 5,1 до 6,0 ммоль / л считаются высокими и требуют мониторинга и контроля. Уровни выше 6.0 ммоль / л опасны.

Гиперкалиемия в большинстве случаев протекает бессимптомно или проявляет очень мало симптомов. Однако когда симптомы действительно присутствуют, они похожи на те, которые возникают при гипокалиемии.

Тяжелая или внезапная гиперкалиемия может вызвать учащенное сердцебиение, одышку и боль в груди. На этом этапе гиперкалиемия может стать опасным для жизни состоянием, требующим немедленной медицинской помощи.

Снижение потребления калия

Гиперкалиемия лечится путем снижения потребления калия.

Калий и натрий являются частью постоянного уравновешивающего действия в организме. Поддержание этого баланса жизненно важно для бесперебойной работы систем организма.

При подозрении на гиперкалиемию лучше избегать продуктов с высоким содержанием калия, таких как перечисленные выше. Также не следует употреблять заменители соли, лечебные травы или добавки. Все они могут повысить уровень калия, а не сбалансировать его.

Высокий уровень калия был связан с двумя случаями остановки сердца.Если почки не могут удалить избыток калия из крови, воздействие калия на сердце может быть фатальным.

Калий жизненно важен для функционирования организма, но сам по себе не является ответом на вопрос о здоровом образе жизни. Общий режим питания и диетический баланс наиболее важны для укрепления здоровья и сдерживания болезней.

.

Измерение скорости потребления кислорода (OCR) и ...

Аннотация

Клетки млекопитающих генерируют АТФ в результате митохондриального (окислительное фосфорилирование) и немитохондриального (гликолиз) метаболизма. Известно, что раковые клетки перепрограммируют свой метаболизм, используя различные стратегии для удовлетворения энергетических и анаболических потребностей (Koppenol et al. , 2011; Zheng, 2012). Кроме того, каждая раковая ткань имеет свои индивидуальные особенности метаболизма.Митохондрии не только играют ключевую роль в энергетическом обмене, но и в регуляции клеточного цикла клеток. Следовательно, митохондрии стали потенциальной мишенью для противоопухолевой терапии, поскольку они структурно и функционально отличаются от своих незлокачественных аналогов (D'Souza et al. , 2011). Мы подробно описываем протокол измерения скорости потребления кислорода (OCR) и скорости внеклеточного закисления (ECAR) в живых клетках с использованием анализатора внеклеточного потока Seahorse XF24 (рис. 1).Анализатор внеклеточного потока Seahorse XF24 непрерывно измеряет концентрацию кислорода и поток протонов в супернатанте клетки с течением времени (Wu et al. , 2007). Эти измерения преобразуются в значения OCR и ECAR и позволяют проводить прямую количественную оценку митохондриального дыхания и гликолиза. С помощью этого протокола мы стремились оценить базальную митохондриальную функцию и митохондриальный стресс трех различных линий раковых клеток в ответ на цитотоксическое тестируемое соединение менсакарцин, чтобы исследовать механизм его действия.Клетки помещали в планшеты для культивирования клеток XF24 и выдерживали в течение 24 часов. Перед анализом культуральную среду заменяли небуферизованной средой DMEM pH 7,4, а затем клеткам давали уравновеситься в инкубаторе без CO 2 непосредственно перед анализом метаболического потока с использованием Seahorse XF, чтобы обеспечить точные измерения изменений единиц милли-pH. , OCR и ECAR измеряли в исходных условиях и после инъекции соединений через порты для инъекций лекарств. С помощью описанного протокола мы оцениваем основные профили энергетического метаболизма трех клеточных линий, а также ключевые параметры функции митохондрий в ответ на наше тестируемое соединение и путем последовательного добавления агентов, нарушающих митохондрии, олигомицина, FCCP и ротенона / антимицина A.


Рис. 1. Обзор эксперимента с морским коньком

Ключевые слова: биоэнергетика, морской конек XF, митохондриальный метаболизм, гликолиз, митохондриальное дыхание

Общие сведения

Натуральные продукты - это небольшие молекулы, которые изолированы от природных источников. За последнее столетие эти молекулы сыграли важную роль в лечении болезней человека, особенно в химиотерапевтических препаратах. Метаболиты, такие как таксол, винкристин и доксорубицин, произвели революцию в том, как мы лечим злокачественные опухоли, и другие природные продукты, например рапамицин, олигомицин и бафиломицин, используются в качестве молекулярных зондов и позволяют проводить молекулярные исследования биохимических и клеточных процессов в лаборатории.Изучая механизм действия цитотоксического природного продукта менсакарцина, мы обнаружили, что флуоресцентно меченый зонд менсакарцина локализуется в значительной степени в митохондриях (Plitzko et al. , 2017). Чтобы выяснить, могут ли цитотоксические свойства менсакарцина быть результатом нарушения функции митохондрий, мы попытались изучить влияние менсакарцина на биоэнергетику клеток. Используя анализатор внеклеточного потока Seahorse, мы отслеживали уровни потребления кислорода клетками (OCR) и скорость внеклеточного закисления (ECAR) в режиме реального времени в качестве показателей митохондриального дыхания и гликолиза соответственно (Wu et al., 2007; Serill et al. , 2015). Анализатор внеклеточного потока Seahorse XF24 позволяет непрерывно проводить прямую количественную оценку митохондриального дыхания и гликолиза живых клеток. В приборе используется картридж сенсора в формате 24-луночного планшета, каждый сенсор снабжен двумя встроенными флуорофорами: один гасится кислородом (O 2 ), а другой чувствителен к изменению pH. Во время измерений картридж датчика опускается на 200 мкм над монослоем клеток, образуя микрокамеру объемом около 2 мкл.Прибор «Морской конек» содержит пучки волоконно-оптических кабелей, которые излучают свет, возбуждают флуорофоры и затем измеряют изменение излучения флуорофора. Очень маленький испытательный объем, образованный переходной микрокамерой, позволяет проводить чувствительные, точные и неразрушающие измерения параметров в реальном времени. Изменения концентрации кислорода и pH автоматически рассчитываются и сообщаются как скорость потребления кислорода (OCR) и скорость дополнительного подкисления клеток (ECAR). После завершения измерения датчики поднимаются, что позволяет большему объему среды выше смешаться со средой в переходной микрокамере, восстанавливая значения до базового уровня.Картридж сенсора содержит порты, позволяющие последовательно добавлять до четырех соединений на лунку во время аналитических измерений.

С помощью описанного протокола мы оценили энергетический метаболизм трех клеточных линий (HCT-116, SK-Mel-28 и SK-Mel-5) (рис. 6). Было обнаружено, что добавление менсакарцина оказывает выраженное влияние на базальную OCR клеток меланомы и не влияет на усиление ECAR. Повышение гликолиза часто наблюдается как компенсаторная реакция. Митохондрии необходимы для энергетического метаболизма клеток и играют ключевую роль в апоптотической гибели клеток.Нарушение митохондриального дыхания или равновесия между проапоптотическими и антиапоптотическими белками может вызвать митохондриальную недостаточность. Чтобы получить представление об индуцированном митохондриальном поражении в клетках меланомы, мы оценили ключевые параметры митохондриального дыхания, последовательно подвергая клетки воздействию хорошо описанных реагентов, нарушающих митохондрии. После добавления нашего тестируемого соединения менсакарцина мы последовательно добавляли олигомицин, FCCP и, наконец, ротенон и антимицин A (рис. 5).Олигомицин ингибирует АТФ-синтазу и снижает OCR, FCCP отделяет потребление кислорода от продукции ATP и увеличивает OCR до максимального значения, а антимицин A и ротенон нацелены на цепь переноса электронов и снижают OCR до минимального значения. Протокол стресс-теста митохондрий предоставляет информацию о базальном дыхании, АТФ-связанном дыхании, утечке протонов, максимальной дыхательной способности и немитохондриальном дыхании клеток. Следовательно, этот анализ может быть использован для понимания механизма действия соединений, которые непосредственно воздействуют на митохондриальное дыхание.

Традиционные измерения функции митохондрий или гликолиза требуют кислородного электрода или наборов и красителей, которые используют колориметрическое или флуориметрическое обнаружение (Li and Graham, 2012; TeSlaa and Teitell, 2014). Большинство из этих методов являются инвазивными и громоздкими, которые допускают только небольшую пропускную способность. Напротив, анализатор Seahorse с его системой картриджей сенсоров позволяет измерять митохондриальное дыхание и гликолиз в режиме реального времени неинвазивным способом, не требующим каких-либо красителей или этикеток.Исследования клеточного энергетического метаболизма очень актуальны во всех областях клеточной биологии млекопитающих. Следующий протокол был разработан для исследователей в области биологии рака, но с подходами, которые подходят для изучения энергетического метаболизма во всех системах клеток млекопитающих.

Материалы и реагенты

  1. CELLSTAR ® Планшеты для культивирования тканей, 96-луночные (Greiner Bio One International, номер по каталогу: 655180)
  2. Стерильные наконечники для пипеток со штативом (1 мл и 200 мкл) (VWR, номера по каталогу: 613-0738; 613-0742)
  3. Стерильные бассейны (Corning, Costar ® , каталожный номер: 4870)
  4. Стерильные пробирки с реагентами (15 и 50 мл) (VWR, каталожные номера: 89039-668; 89039-662)
  5. Стерильные серологические пипетки (5, 10, 25, 50 мл) (Fisher Scientific, каталожные номера: 13-678-11, 13-678-11D, 13-678-11E, 13-678-11F)
  6. Стеклянные флаконы (500 мл) (Fisher Scientific, каталожный номер: FB8001000)
  7. Клетки HCT-116, SK-Mel-5 и SK-Mel-28 (ATCC, каталожные номера: CCL-247, HTB-70, HTB-72)
  8. Seahorse XF24 FluxPak (включая картриджи датчиков, планшеты для культур тканей, калибровочный раствор и калибровочные планшеты) (Agilent Technologies, Санта-Клара, Калифорния)
  9. Трипсин / ЭДТА (0.25% / 2,21 мМ) (Corning, каталожный номер: 25-053-Cl)
  10. 1x Ca 2+ / Mg 2+ DPBS без (Thermo Fisher Scientific, Gibco TM , каталожный номер: 141
)
  • Жидкая среда Игла, модифицированная Дульбекко (DMEM) (Corning, каталожный номер: 10-013)
  • Фетальная бычья сыворотка (FBS) (Atlanta Biologicals, каталожный номер: S11150)
  • Раствор пенициллина / стрептомицина 100x (Corning, номер по каталогу: 30-002-Cl)
  • Порошок модифицированной Дульбекко среды Игла (DMEM) без Na 2 HCO 3 , без HEPES (Corning, каталожный номер: 50-013)
  • Гидроксид натрия (NaOH) (VWR, номер в каталоге: 97064-476)
  • Олигомицин (Merck, каталожный номер: 495455-10MG)
  • ДМСО (VWR, каталожный номер: BDh2115-1LP)
  • FCCP (Cayman Chemical, каталожный номер: 15218)
  • Ротенон (Cayman Chemical, каталожный номер: 13995)
  • Антимицин A (Enzo Life Sciences, номер по каталогу: ALX-380-075-M005)
  • Питательные среды (10% (об.) FBS) (см. Рецепты)
  • Среда для анализа (см. Рецепты)
  • NaOH (1 M) (см. Рецепты)
  • Олигомицин (10 мкМ) (см. Рецепты)
  • FCCP (5 мкМ) (см. Рецепты)
  • Ротенон (5 мкМ) / антимицин A (5 мкМ) (см. Рецепты)
  • Оборудование

    1. Гемацитометр (Hausser Scientific, каталожный номер: 1490)
    2. Шкаф биологической безопасности, класс II, тип A2 (NuAire, модель: NU-425-400ES)
    3. Анализатор внеклеточного потока Seahorse XF (Agilent Technologies, Санта-Клара, Калифорния)
    4. Pipet-Lite Pipette XLS STD 20 XLS (Mettler Toledo, Rainin, модель: SL-2XLS +)
    5. Pipet-Lite Pipette XLS STD 200 (Mettler Toledo, Rainin, модель: SL-200XLS +)
    6. Pipet-Lite Pipette XLS 1000 (Mettler Toledo, Rainin, модель: SL-1000XLS +)
    7. Многоканальный дозатор Pipet-Lite XLS 8-CH 1200 (Mettler Toledo, Rainin, модель: L8-1200XLS +)
    8. Многоканальный дозатор Pipet-Lite XLS 8-CH 200 (Mettler Toledo, Rainin, модель: L8-200XLS +)
    9. Насос аспирационный
    10. Увлажненный инкубатор без CO 2 (XF Prep Station; Agilent Technologies, Санта-Клара, Калифорния)
    11. Мелководная баня (Thermo Fisher Scientific, Thermo Scientific TM , модель: Precision 180)
    12. Контроллер дозатора (BrandTech Scientific, модель: Accu-Jet ® Pro, номер по каталогу: 26330)
    13. Увлажненный, 37 ° C, 5% CO 2 инкубатор (Eppendorf, модель: Galaxy ® 170 R)
    14. Биомедицинская морозильная камера -20 ° C (Sanyo, модель: MDF-U731M)
    15. Автоклав (объединенные системы стерилизации, модель: SSR-3A, ADVPB)
    16. Инвертированный световой микроскоп (Nikon Instruments, модель: Eclipse TS100)
    17. pH-метр с полумикроэлектродом (Thermo Fisher Scientific, Thermo Scientific TM , модель: Orion Star TM A211, с электродом ROSS 8103BN: (Thermo Fisher Scientific, Thermo Scientific TM , номер по каталогу: 8103BN)

    Программное обеспечение

    1. Программное обеспечение Seahorse Bioscience XF24
    2. Excel (Microsoft)
    3. Призма GraphPad 5.0 (GraphPad Software, Inc., Ла-Хойя, Калифорния)

    Процедура

    1. Оптимизация плотности посева
      В начальном эксперименте оптимальная плотность посева требуется для каждого типа клеток. Обычно плотность клеток составляет от 10 000 до 60 000 клеток на лунку и может широко варьироваться в зависимости от клеточной линии. Первой точкой ориентации может быть номер ячейки, обеспечивающий слияние прибл. 95% в течение ночи в 96-луночном планшете для культивирования клеток, поскольку посевная поверхность сопоставима с поверхностью для культивирования морского конька.Количество засева должно давать сливной, здоровый и устойчивый монослой в день проведения анализа.
      1. Клетки HCT-116, SK-Mel-5 и SK-Mel-28 высевали в планшет для культивирования клеток Seahorse XF24 при различных концентрациях от 10 000 до 30 000 клеток / лунку с помощью двухэтапной техники посева, как описано ниже в Процедуре B ( Фигура 2). Рекомендуется высев клеток в трех экземплярах.


        Рис. 2. Схема планшета для оценки плотности клеток. Здесь показан примерный план посева для клеточных линий SK-Mel-5 и SK-Mel-28 (плотность посева для клеток HCT-116 оценивалась на втором планшете; не показано).

      2. Затем клетки анализировали в приборе XF24, как описано в процедуре E (без загрузки соединений в порты), используя команды таблицы 1.

        Таблица 1. Команды протокола для оценки плотности клеток

        Как видно на рисунке 3, линейное увеличение значений OCR с увеличением плотности клеток наблюдалось во всех трех линиях клеток. Значения ECAR начинают выравниваться на уровне 20000 клеток / лунку для SK-Mel-28 и SK-Mel-5, в то время как для HCT-116 они намного ниже и постоянно увеличиваются.Таким образом, было выбрано количество посева 20000 клеток на лунку для SK-Mel-28 и SK-Mel-5 и 35000 клеток на лунку для HCT-116, чтобы гарантировать, что они находятся в пределах линейного диапазона ответа при высоких значениях считывания, чтобы наблюдать увеличение а также снижение OCR и ECAR.


        Рисунок 3. Оптимизация условий анализа: оценка OCR и ECAR в зависимости от плотности посева трех различных клеточных линий


    2. Посев клеток в планшет для культивирования тканей Seahorse XF24 (день 1)
      Примечание. Посев и выращивание клеток выполняются с использованием хорошей методики культивирования стерильных клеток. Двухэтапный метод посева используется для получения однородного ровного монослоя, который жизненно важен для получения последовательных и точных данных:
      1. Предварительно нагрейте питательную среду, раствор трипсина и DPBS до 37 ° C.
      2. Для прикрепленных клеток промойте клетки DPBS, добавьте трипсин и подождите, пока клетки не начнут отделяться. Добавьте культуральную среду с сывороткой для дезактивации трипсина и пипеткой вверх и вниз, чтобы создать однородную суспензию клеток. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра и ресуспендируйте клетки в питательной среде до желаемой конечной концентрации для посева в 100 мкл.
      3. Планшет 100 мкл клеточной суспензии в планшет для культуры ткани Seahorse XF24. Поместите только среду (без клеток) в лунки для коррекции фона (A1, B4, C3, D6).
      4. Оставьте культуральную чашку на 1 час в биозащитном кожухе, не перемещая ее (для равномерного оседания клеток).
      5. Поместите культуральный планшет в инкубатор (37 ° C, 5% CO 2 ) на 4 часа.
      6. Осторожно добавьте 150 мкл питательной среды (конечный объем в лунке 250 мкл).Держите наконечник пипетки под углом и добавляйте в лунку, чтобы не разрушить ровный слой вновь прикрепившихся клеток.
      7. Позвольте клеткам расти в течение ночи при 37 ° C, 5% CO 2 .

    Примечание. Следующие шаги выполняются без использования стерильных средств, но необходимо соблюдать осторожность, чтобы клетки и оборудование были как можно более чистыми.
    1. Датчики гидратации (день 1)
      1. Откройте XF 24 FluxPak и выньте картридж датчика (зеленый) и калибровочную пластину (прозрачную) (Рисунок 4).


        Рис. 4. Картридж датчика Seahorse XF 24. A. Картридж датчика находится наверху калибровочной пластины с показанными отверстиями для впрыска. B. Нижняя сторона сенсорной пластины, на которой показаны сенсоры со встроенными флуорофорами.

      2. Поместите картридж датчика (датчики вверх) рядом с калибровочной пластиной (будьте осторожны, не касайтесь датчиков).
      3. Заполните каждую лунку калибровочного планшета по 1 мл калибранта Seahorse XF.
      4. Опустите картридж датчика на калибровочную пластину, погрузив датчики в калибрант (будьте осторожны, не касайтесь стенок датчиками).
      5. Поместите в инкубатор без CO 2 37 ° C на ночь. Чтобы предотвратить испарение калибранта XF, убедитесь, что инкубатор увлажнен должным образом.

    2. Стабилизация инструмента (день 1)
      1. Включите анализатор XF24, откройте программное обеспечение Seahorse Bioscience и войдите в систему.
      2. Напишите шаблон анализа. При планировании и написании протокола анализа будьте осторожны, чтобы не создать протокол, который длиннее, чем клетки могут обойтись без CO 2 в небуферизованной среде.В зависимости от типа ячейки это 2-3 часа. Если есть сомнения, анализ жизнеспособности клеток можно провести после анализа морского конька.
      3. Оставьте анализатор XF24 на ночь с запущенным программным обеспечением XF24 и войдите в систему, чтобы обеспечить уравновешивание до 37 ° C.

    3. Анализ морского конька (день 2)
      1. Проверить слияние ячеек. Необходимо равномерное расстояние между ячейками, без больших скоплений ячеек или пустых участков, так как это может снизить точность данных.
      2. Предварительно нагрейте среду для анализа до 37 ° C.
      3. Предварительно нагрейте соединения и при необходимости доведите pH до 7,4 с помощью NaOH (1 M).
      4. Выполните обмен среды в планшете для культуры ткани Seahorse XF24:
        1. Удалите 150 мкл ростовой среды с помощью многоканальной пипетки.
        2. Добавьте 1 мл среды для анализа с помощью многоканальной пипетки.
        3. С помощью многоканальной пипетки удалите 1 мл.
        4. Добавьте 475 мкл среды для анализа с помощью многоканальной пипетки (конечный объем 575 мкл).
        5. Поместите планшет с клетками в инкубатор без CO 2 на прибл. 60 мин.
      5. Загрузите картридж с желаемыми соединениями:
        1. Предварительно нагрейте состав до 37 ° C.
        2. Загрузите 50–100 мкл соединения в соответствующий порт картриджа (для митохондриального стресс-теста: 64 мкл в порт A, 71 мкл в порт B, 79 мкл в порт C, 88 мкл в порт D). (см. Примечание 1) Загрузите эквивалентные количества среды для анализа в эквивалентный порт для фоновых лунок (см. Примечание 2).
        3. Поместите обратно в инкубатор (без CO 2 ) на 10 минут, чтобы снова нагреться до 37 ° C. Обращайтесь осторожно, переносите только за калибровочную пластину. Двигайтесь как можно меньше.
      6. Калибровка и запуск анализа морских коньков:
        1. Загрузите шаблон анализа в программное обеспечение Seahorse XF24.
        2. Нажмите зеленую кнопку «СТАРТ».
        3. Убедитесь, что вы загрузили правильный протокол, правильный каталог для сохранения и имя для сохранения.
        4. Нажмите старт'.
        5. Загрузите картридж датчика с калибровочной пластиной в лоток для инструментов (выемка идет в переднем левом углу. Убедитесь, что пластина установлена ​​правильно и ровно между всеми 8 выступами)
        6. Следуйте инструкциям на экране, чтобы откалибровать и уравновесить датчики.
        7. После завершения шага уравновешивания удалите калибровочный планшет и замените его планшетом для культивирования клеток.

    4. Команды протокола (митохондриальный стресс-тест, таблица 2, рисунок 5)

      Таблица 2. Протоколные команды для митохондриального стресс-теста

    5. Анализ данных

      Первоначально результаты были просмотрены с помощью программы просмотра данных seahorse XF, которая автоматически сохраняет данные в виде файла MS Excel (.xls). Графический и статистический анализ проводился с использованием GraphPad Prism. Достоверность наблюдаемых различий базовой биоэнергетики клеточных линий оценивали с помощью непараметрического теста Краскела-Уоллиса с последующим апостериорным тестом множественного сравнения Данна.Во всех случаях значимым считалось P <0,05. Экспериментальные значения представлены в виде среднего ± стандартное отклонение (рисунок 5) или в виде прямоугольной диаграммы (рисунок 6).


      Рисунок 5. Митохондриальный стресс-тест. OCR измеряли после инъекции менсакарцина (черная стрелка) в различных концентрациях в клетки SK-Mel-28 с последующими последовательными инъекциями олигомицина (1 мкМ), FCCP (0,5 мкМ) и антимицина A (0,5 мкМ) / ротенона (0,5 мкМ). мкМ) (n = 3).


      Рисунок 6.Базальное биоэнергетическое состояние клеток SK-Mel-28, SK-Mel-5 и HCT-116. Базальный энергетический метаболизм каждой клеточной линии оценивали путем анализа соотношений OCR / ECAR. OCR и ECAR были получены по тому же протоколу, что и описанный выше, но без введения соединений. Команды протокола состояли из одного цикла с 8 измерениями. Было выполнено несколько отдельных анализов (n = 25).

      Ноты

      1. Вставьте пипетку в порты под углом, не касайтесь дна, не постукивайте, чтобы предотвратить утечку.Жидкость удерживается только капиллярными силами.
      2. В порты фоновых лунок обязательно загружать аналитическую среду, которая содержит такую ​​же концентрацию ДМСО, как и соединения, чтобы учесть любое воздействие ДМСО на клетки.
      3. После закачки в лунки соединения разбавляют 1:10. Это даст конечную концентрацию 1 мкМ олигомицина и 0,5 мкМ FCCP, ротенона и антимицина А, соответственно, в лунке для культивирования клеток.

      Рецепты

      1. Питательная среда (10% (об. / Об.) FBS)
        Примечание. Работайте в стерильных условиях в вытяжном шкафу с ламинарным потоком.
        1. Открытая бутылка с жидкостью DMEM
        2. Вынуть 55 мл стерильной серологической пипетки и слить жидкость
        3. Добавьте 50 мл FBS стерильной серологической пипеткой
        4. Добавьте 5 мл раствора пенициллина / стрептомицина
        5. Хранить при 4 ° C
      2. Среда для анализа (стерильная, небуферизованная, 250 мл)
        Примечание. Работайте в стерильных условиях в вытяжном шкафу с ламинарным потоком.
        1. Автоклав Ultrapure 250 мл H 2 O в стеклянной бутылке
        2. Растворите 3,34 г порошка DMEM без NaHCO 3 и без HEPES в 250 мл автоклавированной H 2 O
        3. От тепла до 37 ° C
        4. Довести pH до 7,40 с помощью NaOH (1 M)
        5. Хранить при 4 ° C
      3. NaOH (1 M)
        Растворить гранулы NaOH 4 г в автоклаве объемом 100 мл H 2 O
      4. Олигомицин (10 мкМ)
        1. Свежее приготовление в день анализа морских коньков (день 2) (см. Примечание 1)
        2. Приготовьте 1 мМ раствор в 1 мл ДМСО: Dissolve 0.7911 мг олигомицина в ДМСО
        3. Разбавьте до 10 мкМ в среде для анализа (1% ДМСО): внесите пипеткой 20 мкл 1 мМ олигомицина в 1,980 мкл среды для анализа
        4. Нагрейте до 37 ° C и при необходимости доведите до pH 7,4 с помощью NaOH (1 M)
      5. FCCP (5 мкМ)
        1. Свежее приготовление в день анализа морских коньков (день 2) (см. Примечание 1)
        2. Приготовьте 50 мМ раствор в ДМСО: растворите 2,54 мг FCCP в 200 мкл ДМСО
        3. Разбавьте до 500 мкМ: внесите пипеткой 10 мкл 50 мМ FCCP в 990 мкл ДМСО
        4. Разбавьте до 5 мкМ в среде для анализа (1% ДМСО): внесите пипеткой 20 мкл 500 мкМ FCCP в 1,980 мкл среды для анализа
        5. Нагрейте до 37 ° C и доведите до pH 7.4 с NaOH (1 M) при необходимости
      6. Ротенон (5 мкМ) / антимицин А (5 мкМ)
        1. Свежее приготовление в день анализа морских коньков (день 2) (см. Примечание 1)
        2. Приготовьте 50 мМ раствор в ДМСО: растворите 3,94 мг ротенона и 5,49 мг антимицина А в 200 мкл ДМСО
        3. Разбавьте до 1 мМ: внесите пипеткой 10 мкл 50 мМ ротенона / антимицина А в 490 мкл ДМСО
        4. Разбавьте до 5 мкМ в аналитической среде (0,5% ДМСО): внесите пипеткой 20 мкл 1 мМ ротенона / антимицина А в 1980 мкл аналитической среды
        5. Нагрейте до 37 ° C и доведите до pH 7.4 с NaOH (1 М) при необходимости

      Подтверждения

      Работа в основном поддержана стартовыми фондами ОГУ. Артериальное давление благодарит DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft) за финансирование постдокторантуры (PL 799 / 1-1). Мы хотим поблагодарить доктора Напура Панде за предоставление клеток SK-Mel-28 и компанию Bioviotica (проф. Доктора Акселя Зика и Ханса-Петера Кролла) за предоставление менсакарцина. Мы хотели бы поблагодарить Элизабет Н. Кависа за помощь с этим протоколом, а также доктора Джеффри Д. Серрилла и проф.Джейн Э. Измаил за информацию и отзывы об экспериментах с морскими коньками. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов или конкурирующих интересов.

      Ссылки

      1. Д’Суза, Г. Г., Уэгл, М. А., Саксена, В., и Шах, А. (2011). Подходы к нацеливанию на митохондрии в терапии рака. Biochim Biophys Acta 1807 (6): 689-696.
      2. Коппенол, В. Х., Баундс, П. Л. и Данг, К. В. (2011). Вклад Отто Варбурга в современные концепции метаболизма рака. Nat Rev Cancer 11 (5): 325-337.
      3. Ли З. и Грэм Б. Х. (2012). Измерение потребления кислорода митохондриями с помощью электрода Кларка. Методы Мол Биол 837: 63-72.
      4. Плитцко, Б., Кависа, Э. Н. и Лесген, С. (2017). Натуральный продукт менсакарцин вызывает митохондриальную токсичность и апоптоз в клетках меланомы. J Biol Chem 292 (51): 21102-21116.
      5. Серилл, Дж. Д., Тан, М., Фоцо, С., Сикорска, Дж., Касана, Н., Хау, А. М., Макфейл, К. Л., Сантоза, Д. А., Забриски, Т. М., Махмуд, Т., Виолле, Б., Протеу, П. Дж. И Измаил, Дж. Э. (2015). Апоптолодины A и C активируют AMPK в метаболически чувствительных типах клеток и механически отличаются от олигомицина A. Biochem Pharmacol 93 (3): 251-256.
      6. ТеСлаа, Т., Тейтелл, М.А. (2014). Методы контроля гликолиза. Methods Enzymol 542: 91-114.
      7. Ву, М., Neilson, A., Swift, AL, Moran, R., Tamagnine, J., Parslow, D., Armistead, S., Lemire, K., Orrell, J., Teich, J., Chomicz, S. и Феррик, Д.А. (2007). Многопараметрический метаболический анализ показывает тесную связь между ослабленной биоэнергетической функцией митохондрий и повышенной зависимостью от гликолиза в опухолевых клетках человека. Am J Physiol Cell Physiol 292 (1): C125-136.
      8. Чжэн, Дж. (2012). Энергетический метаболизм рака: гликолиз против окислительного фосфорилирования (обзор). Oncol Lett 4 (6): 1151-1157.
    Пожалуйста, войдите или зарегистрируйтесь, чтобы просмотреть полный текст

    Просмотр полного текста

    Скачать PDF

    Вопрос &

    Авторские права: © 2018 Авторы; эксклюзивный лицензиат ООО «Биопротокол».

    ,

    Как рассчитать расход газа в газовой горелке

    Совет

    Сжиженный нефтяной (LP) газ - это пропан, смешанный с бутаном и помещенный под давлением для его сжижения. Энергетическая ценность сжиженного нефтяного газа составляет 91 000 БТЕ на галлон. Таким образом, горелка-гриль для барбекю на 40 000 БТЕ, использующая пропан с 80-процентной эффективностью, использует (40 000/91 000) /0,80 = 0,55 галлона пропана в час.

    Предупреждение

    Не путайте эффективность устройства с эффективностью горелки. Большинство газовых горелок очень эффективны.Эффективность устройства определяется тем, насколько хорошо устройство использует тепло, выделяемое горелками, и сколько тепла идет вверх по дымоходу.

    Газовые горелки потребляют топливо в соответствии с их мощностью в БТЕ. Природный газ и пропан содержат определенные уровни энергии. Один кубический фут природного газа содержит 1075 БТЕ энергии. Однако газовые горелки не на 100% эффективны. Если вам известен КПД горелки, вы можете рассчитать точный расход топлива на мощность горелки.Если вы этого не сделаете, вам придется использовать приближение. Сжиженный нефтяной газ и природный газ содержат разное количество энергии, поэтому коэффициент преобразования разный.

    ,

    Смотрите также